植酸含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5845

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入4mL試劑一，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2、 試劑三：臨用前加入2.36mL蒸餾水充分溶解，再將槍頭伸入液面下緩慢加入0.64mL濃硫酸，充分混合；2-8℃可以保存4周；

3、 試劑四：臨用前加入15mL蒸餾水充分溶解，再將槍頭伸入液面下緩慢加入15μL濃硫酸，充分混合；2-8℃可以保存4周；

4、 工作液：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑三：試劑四=1mL:5 mL(共6mL，40T)的比例混勻，配置后當(dāng)天用完；

5、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1.08mL試劑一充分溶解，配制成10μmol/mL植酸標(biāo)準(zhǔn)品，2-8℃保存4周；

6、 250nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品的配制：臨用前取50μL 10μmol/mL植酸標(biāo)準(zhǔn)品和450μL蒸餾水混合為1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品（即1000nmol/mL）；再取250μL 1000nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品和750μL蒸餾水混合配制成250nmol/mL植酸標(biāo)準(zhǔn)品，用于下述操作表標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

植酸（Phytic acid），又名肌醇六磷酸、環(huán)己六醇六磷酸，普遍存在于真核細(xì)胞，在許多細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如：維持無(wú)機(jī)磷穩(wěn)態(tài)、參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、作為酶的輔助因子參與DNA修復(fù)、RNA編輯和mRNA輸出。植酸在植物發(fā)芽和生長(zhǎng)過(guò)程中提供主要磷源，廣泛存在于谷類、豆類、水果、蔬菜和干果等植物性食物中。

在一定的環(huán)境條件下，植酸酶可以分解植酸鈉（肌醇六磷酸十二鈉）產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷和肌醇衍生物，在酸性條件下，無(wú)機(jī)磷和鉬酸銨顯色劑發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的鉬藍(lán)物質(zhì)，其在700nm有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的含量，可計(jì)算出植酸含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、濃硫酸（>98%，AR）、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 新鮮植物樣本：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，充分勻漿后，常溫震蕩2h，然后于4℃，10000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 10000g離心10min后取上清待測(cè)。

2. 干粉類植物樣本：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~20的比例（建議稱取約0.05g，加入1mL提取液一）加入提取液一，充分勻漿后，常溫震蕩2h，然后于4℃，10000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 10000g離心10min后取上清待測(cè)。

3. 液體樣本：取100μL液體加入1mL提取液一，常溫震蕩2h，然后于4℃，10000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 10000g離心10min后取上清待測(cè)。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2 mL EP管進(jìn)行操作。

二、測(cè)定步驟

1．可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至700nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2．操作表：（1.5mLEP管中加入下列試劑）

三、植酸含量計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

植酸含量（nmol/mg prot）= ΔA測(cè)定×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣÷(V樣×Cpr) =250×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

植酸含量（nmol/g 質(zhì)量）= ΔA測(cè)定×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×(V上清+V提取液二)÷(W×V上清÷V提取液一)

=296.875×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

3. 按液體體積計(jì)算

植酸含量（nmol/mL）=ΔA測(cè)定×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×(V上清+V提取液二)÷[V液體×V上清÷(V提取液一+V液體)]

=3265.625×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，250nmol/mL；V樣：加入樣本體積，0.12mL；V上清：提取時(shí)上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V液體：液體樣本體積，0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

1、 如果?A測(cè)定小于0.010或測(cè)定管吸光值接近空白管，可以增加樣本量后再進(jìn)行測(cè)定；如果?A測(cè)定大于1，建議將樣本上清用蒸餾水適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

2、 如果樣本加入工作液后出現(xiàn)渾濁，建議將樣本上清用蒸餾水適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

3、 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。如需測(cè)定蛋白含量，需另取樣本。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 稱取0.1044g洋蔥樣本，按照提取步驟和測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算：ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.411-0.375=0.036，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.811-0.096=0.715，按樣本質(zhì)量計(jì)算得：

植酸含量（nmol/g 質(zhì)量）=296.875×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=143.18nmol/g 質(zhì)量。

2. 稱取0.05g小麥粉，按照提取步驟和測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算：ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.331-0.188=0.143，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.811-0.096=0.715，按樣本質(zhì)量計(jì)算得：

植酸含量（nmol/g 質(zhì)量）=296.875×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=1187.5nmol/g質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Senna R, Simonin V, Silva-Neto M A C, et al. Induction of acid phosphatase activity during germination of maize (Zea mays) seeds.[J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2006, 44(7-9):467-473.

[2] Iqbal T H, Lewis K O, Cooper B T. Phytase activity in the human and rat small intestine[J]. Gut, 1994, 35(9):1233-1236.

[3] Azeke M A, Egielewa S J, Ihimire E. Effect of germination on the phytase activity, phytate and total phosphorus contents of rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), millet (Panicum miliaceum), sorghum (Sorghum bicolor) and wheat (Triticum aestivum)[J]. Journal of Food Science&Technology, 2011.

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