低密度脂蛋白膽*醇（LDL-C）含量檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC5335

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：自備異丙醇，大約需要110mL，常溫保存；試劑盒內(nèi)提供一個30mL棕色空瓶，僅做分裝使用，請自行標(biāo)注試劑名稱。

2. 試劑一C：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。

3. 試劑一的配制：根據(jù)樣本量將試劑一A：試劑一B：試劑一C按2.25 mL：20 μL：3 μL（2.273mL，約12T）的比例進(jìn)行配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，當(dāng)天用完。

4. 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg膽*醇，臨用前加入517 μL提取液，振蕩溶解，即為50 μmol/mL的膽*醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，2-8℃可保存4周。

產(chǎn)品說明：

產(chǎn)品說明：

低密度脂蛋白是血清脂蛋白中膽*醇含量最高的一種脂蛋白，其顆粒較小，主要作用是將肝臟組織的膽*醇經(jīng)過血液轉(zhuǎn)運至其他組織，促進(jìn)組織細(xì)胞中膽*醇的積累。眾多流行病學(xué)研究表明，血清低密度脂蛋白膽*醇（Low-Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）水平與動脈粥樣硬化（AS）、冠心?。?/span>GHD）呈正相關(guān)，對于臨床診斷動脈粥硬化、冠心病、高血壓等疾病有重要參考價值。

使用選擇性表面活性劑，特異性解離出CM、VLDL、HDL中的膽*醇，而不作用于LDL，解離出的膽*醇與膽*醇酯酶(CHER)和膽*醇氧化酶(CHOD)反應(yīng)產(chǎn)生H₂O₂，在缺乏顯色劑的情況下被消耗掉而不顯色；未被分解的LDL在另一特異性表面活性劑的作用下解離，利用酯酶催化膽*醇酯水解生成游離膽*醇（FC）和游離脂肪酸（FFA），從而把膽*醇酯轉(zhuǎn)化為FC；進(jìn)一步利用膽*醇氧化酶催化FC氧化，生成4-膽甾烯酮和H₂O₂；最后利用過氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基*替比林和苯胺類似物，生成紫色化合物，其在546nm有特征吸收峰。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者

增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、可調(diào)式移液槍、冰、蒸餾水、異丙醇（AR）。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲2秒，間隔3秒，總時間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清（漿）等液體樣本：直接測定。若有沉淀請離心后取上清待測。

二、測定步驟

1. 可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至546nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2. 根據(jù)樣本量取試劑一、試劑二37℃預(yù)熱10min。

3. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：將50μmol/mL膽*醇標(biāo)準(zhǔn)溶液用提取液進(jìn)行稀釋得到2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125、0.0390625μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

4. 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋可參考下表：（實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需5µL標(biāo)準(zhǔn)溶液）

5. 在96孔板或微量玻璃比色皿中按下表步驟加樣：

充分混勻，37℃靜置5min，測定546nm處吸光值A2，分別記為A2測定、A2標(biāo)準(zhǔn)、A2空白，計算?A測定=（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白），?A標(biāo)準(zhǔn)=（A2標(biāo)準(zhǔn)-A1標(biāo)準(zhǔn)）-（A2空白-A1空白）。空白管和標(biāo)準(zhǔn)曲線只需測1-2次。

注：若樣本為血清（漿）等液體樣本，則需要增加‘血清（漿）空白管’-即將空白管中的提取液（異丙醇）更換為蒸餾水進(jìn)行實驗，計算ΔA測定=A測定-A血清（漿）空白，標(biāo)準(zhǔn)管測定及ΔA標(biāo)準(zhǔn)計算不變。

三、低密度脂蛋白膽*醇含量計算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2. LDL-C含量的計算：

（1）按血清（漿）等液體體積計算：

LDL-C含量（μmol/dL）=x×100

（2）按樣本蛋白濃度計算：

LDL-C含量（μmol/mg prot）=x×V樣本÷（Cpr×V樣本）=x÷Cpr

（3）按樣本質(zhì)量計算：

LDL-C含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×V樣本÷（W×V樣本÷V提?。?/span>=x÷W

（4）按細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計算：

LDL-C含量(μmol /10⁴ cell)=x×V樣本÷（N×V樣本÷V提?。?/span>= x÷N

100：單位換算系數(shù)，1dL=100mL；V樣本: 加入樣本上清的體積，0.005mL；V提取：加入提取液的體積，1mL；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以萬計。

注意事項：

1. 如果測定吸光值超出線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用提取液稀釋樣本（液體樣本用蒸餾水稀釋）上清后再進(jìn)行測定。注意同步修改計算公式。

2. 提取液中含有使蛋白變性的成分，故按蛋白濃度計算時需要重新提取蛋白進(jìn)行測定。

實驗實例：

1、 取5μL人血清樣本，按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）=（0.515-0.061）-（0.056-0.055）=0.453，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1163x-0.0039，計算x=3.929，按血清（漿）等液體體積計算：

LDL-C含量（μmol/dL）=x×100=3.929×100=392.863 μmol/dL。

2、 取0.11g小鼠肝臟樣本，加入1mL提取液，冰浴勻漿，離心后取上清按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算，ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）=（0.239-0.056）-（0.056-0.055）=0.182，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1163x-0.0039，計算x=1.598，按樣本質(zhì)量計算：

LDL-C含量（μmol/g 質(zhì)量）=x÷W=1.598÷0.11=14.531 μmol/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Hiroyuki S, Tetsumi I, Yoshinori U, et al. Homogeneous assay for measuring low-density lipoprotein cholesterol in serum with triblock copolymer and α-cyclodextrin sulfate[J]. Clinical Chemistry, 1998, 44(3):522-531.

[2] Sakaue T, Hirano T, Yoshino G, et al. Reactions of direct LDL-cholesterol assays with pure LDL fraction and IDL: comparison of three homogeneous methods [J]. Clinica Chimica Acta, 2000, 295(1-2):97-106.

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