線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/NADH-CoQ還原酶活性檢測(cè)試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號(hào)：BC0510
規(guī)格：50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：試劑放于瓶?jī)?nèi)玻璃管內(nèi)，臨用前取一瓶加入2 mL丙 酮，充分溶解，2-8℃可分裝保存1個(gè)月；

2. 試劑三：臨用前加入0.1mL丙 酮，丙 酮 易揮發(fā)，使用完畢后注意封口，-20℃可保存2個(gè)月；

3. 試劑三工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑三：丙 酮=10μL：1mL（約20T）混合備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；

4. 試劑四：臨用前取一瓶加入2.4mL蒸餾水（約30T），現(xiàn)用現(xiàn)配，充分溶解，-20℃可保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融；

5. 工作液的配制：根據(jù)用量將丙 酮：試劑二：試劑三工作液=250μL：250μL：500μL（約10T）混合備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說明：
復(fù)合體Ⅰ（EC 1.6.5.3）又稱NADH-CoQ還原酶或NADH脫氫酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中最大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對(duì)電子從NADH傳遞給CoQ，同時(shí)可使O₂還原生成O^2-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O^2-的主要部位。測(cè)定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)。
復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成NAD⁺，在340nm下測(cè)定NADH的氧化速率計(jì)算出該酶活性的大小。


注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、細(xì)胞超聲破碎儀、丙 酮、冰和蒸餾水。
操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1.0 mL提取液一，用勻漿器或研缽于冰上快速勻漿（約30次）。

2. 4℃ 600 g離心10min，棄沉淀，留上清。上清再次離心，4 ℃ 11000 g離心15min，得到上清液和沉淀。

3. 上一步結(jié)果得到的上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。

4. 在沉淀中加入200μL提取液一和200μL 提取液二，超聲波破碎（功率200W，超聲5秒，間隔10秒，重復(fù)15次），用于復(fù)合體Ⅰ酶活性測(cè)定，并且用于蛋白含量測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1. 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一37℃預(yù)熱15min。

3. 操作表：在1mL石英比色皿中分別加入

三、復(fù)合體Ⅰ活力單位的計(jì)算
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T =3215.43×ΔA÷Cpr
V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過高（A1高于1.5），可用蒸餾水稀釋上清液后再測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）；若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高靈敏度。

2. 樣本蛋白濃度需自行測(cè)定。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測(cè)定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量（約0.5mg/mL）。

3. 推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活。另附按樣本計(jì)算公式和按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算公式

4. 附：使用樣本重量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為50T/24S） 

A、上清中復(fù)合體I活力的計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/g質(zhì)量）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=3215.43×ΔA1÷W
ΔA1：上清測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：
比色皿光徑，1cm；V提?。杭尤胩崛∫?/span>一體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中復(fù)合體I活力的計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/g質(zhì)量）= [ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：沉淀重懸體積（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
C、樣本復(fù)合體I總活力的計(jì)算：
樣本復(fù)合體I總活力即為上清中復(fù)合體I活力與沉淀中復(fù)合體I活力之和。
按樣本質(zhì)量計(jì)算：復(fù)合體I（U/g 質(zhì)量）=3215.43×ΔA1÷W+1286.17×ΔA2÷W

1. 附：使用細(xì)胞數(shù)量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為50T/24S） 

1. 上清中復(fù)合體I活力的計(jì)算：

單位的定義：每10⁶個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V提取×V樣)÷T =3215.43×ΔA1÷N
ΔA1：上清測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：加入提取液一體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；N：細(xì)胞數(shù)量，以10⁶計(jì)；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

1. 沉淀中復(fù)合體I活力的計(jì)算:

單位的定義：每10⁶個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V提取×V樣)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm d：比色皿光徑，1cm；V提取：沉淀重懸體積（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；N：細(xì)胞數(shù)量，以10⁶計(jì)；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

1. 樣本復(fù)合體I總活力的計(jì)算：

樣本復(fù)合體I總活力即為上清中復(fù)合體I活力與沉淀中復(fù)合體I活力之和。
復(fù)合體I總活性（U/10⁶ cell）=3215.43×ΔA1÷N +1286.17×ΔA2÷N
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Huazhang Zhu,Weizhen Zhang,Yingying Zhao,et al. GSK3β-mediated tau hyperphosphorylation triggers diabetic retinal neurodegeneration by disrupting synaptic and mitochondrial functions. Molecular Neurodegeneration. November 2018.

2. Liuqin He,Haiwen Zhang, Xihong Zhou. Weanling Offspring of Dams Maintained on Serine-Deficient Diet Are Vulnerable to Oxidative Stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. September 2018.

3. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018.

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5. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

6. OuYang Q, Tao N, Zhang M. A damaged oxidative phosphorylation mechanism is involved in the antifungal activity of citral against Penicillium digitatum[J]. Frontiers in microbiology, 2018, 9: 239.

參考文獻(xiàn)：

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