果膠裂解酶（PL）活性檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號(hào): BC2645

規(guī)格: 100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 工作液：將試劑一倒入試劑二于50℃水浴中溶解（期間可拿出振蕩數(shù)次）。該試劑易長(zhǎng)菌，配制完成后可-20℃分裝保存，可保存12周。

產(chǎn)品說明：

果膠裂解酶（EC4.2.2.10）是果膠酶的重要組成部分，催化果膠分子鏈的消除裂解。來源比較廣泛，主要來源于微生物，在食品加工工業(yè)中提高果汁產(chǎn)量方面有重要意義，在減少環(huán)境污染和降低能源消耗方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

果膠裂解酶作用于果膠中的α-1,4糖苷鍵，生成在還原端C4和C5之間位置具有不飽和鍵的不飽和寡聚半乳糖醛酸，在235nm處有特征吸收峰，測(cè)定235nm下吸光度的上升來表示果膠裂解酶的活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)胞、細(xì)菌或真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。（細(xì)菌、真菌等難以數(shù)量計(jì)算的微生物也可以稱取0.1g 細(xì)菌/真菌沉淀來進(jìn)行前處理）

3. 培養(yǎng)液：直接測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至235nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 操作表：

三、果膠裂解酶活性計(jì)算

A、按微量石英比色皿計(jì)算：

1. 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PL活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T=64.1×ΔA÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每克組織每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PL活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 64.1×ΔA÷W

1. 按照細(xì)菌、真菌貨細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PL活性（U/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×N÷V樣總）÷T= 64.1×ΔA÷N

3. 按照培養(yǎng)液體積計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PL活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T= 64.1×ΔA

ε：不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數(shù)，5200 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.0002 L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；10⁹：換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；N：細(xì)胞數(shù)量，以萬計(jì)。

B、按96孔UV板計(jì)算：

將上述公式中的d-1cm修改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1、 若A1測(cè)定管大于1.5或者ΔA大于0.5，將樣本粗酶液用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

2、 建議一次測(cè)定不要測(cè)定過多樣本以免耽誤過多的酶促反應(yīng)時(shí)間。

3、 空白管正常情況下變化不超過0.02。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g香蕉皮加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。之后按照測(cè)

定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管= A2測(cè)定管-A1測(cè)定管=0.528-0.5254=0.0026，ΔA=

ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.1551-0.1542=0.0009，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

PL活性（U/g 質(zhì)量）= 64.1×ΔA÷W=1.090 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1g大腸桿菌沉淀加入1mL提取液冰浴超聲波破碎細(xì)胞，然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上，之后按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管= A2測(cè)定管-A1測(cè)定管=1.2213-0.8277=0.3936，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.1551-0.1542=0.0009，按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

3、 PL活性（U/g 質(zhì)量）= 64.1×ΔA÷W=251.721 U/g 質(zhì)量。

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