肝脂酶（HL）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC2385

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、試劑三：臨用前加入10 mL蒸餾水，充分溶解待用，用不完的 2-8℃保存8周；

2、試劑四：臨用前取1支加入1 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑可-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融；

3、標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入6.94 mL丙 酮，配成10 μmol/mL α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分溶解待用，用不完的-20℃保存4周。

產(chǎn)品說明：

肝脂酶（hepaticlipase，HL）是一種脂肪分解酶，在肝實質(zhì)細(xì)胞中合成，存在于肝臟竇周間隙內(nèi)皮細(xì)胞表面和竇周間隙腔面的肝細(xì)胞微絨毛表面，可水解各種脂蛋白中的甘油三酯（TG）和磷脂（PL），使各種脂蛋白顆粒的大小和密度發(fā)生變化，當(dāng)血漿中的HL及其活性增高時，可導(dǎo)致血漿中低密度脂蛋白（LDL）水平升高，加速動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。

肝脂酶水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生α-萘酚，可與固藍(lán)B鹽形成紫紅色偶氮化合物，在595nm有特征吸收峰，其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與肝脂酶活性成正相關(guān)。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、天平、低溫離心機、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、EP管、 丙 酮、蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL試劑一），加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10 min，取上清待測。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1 mL試劑一）加入試劑一，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3 min）；然后于4℃，10000g離心10 min，取上清待測。

3、血清/血漿：直接測定。（若液體有渾濁則離心后進行測定）

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至595 nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2、 將試劑三在30℃預(yù)熱20 min以上。

3、 將10 μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液用試劑一稀釋為5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表

實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需20µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

5、 操作表（在1.5mLEP管或者96孔板中依次加入下列試劑）：

三、HL酶活計算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA（y，ΔA）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2、 HL酶活的計算：

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（U/mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.1x÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克組織每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（U/g 鮮重）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）÷T=0.1x÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細(xì)胞每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（U/10⁴ cell）=x×V樣÷（V樣×N÷V樣總）÷T=0.1x÷N

（4）按液體體積計算

酶活定義：每毫升血清每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T=0.1x

V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.02 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入試劑一體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，10 min；N：細(xì)胞數(shù)量，以萬計。

注意事項：

1、 若樣本為動物肝臟，建議將樣本用試劑一稀釋25倍以上再進行檢測，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2、 若樣本為肥胖型動物血清或血漿，建議將樣本用試劑一稀釋5倍以上再進行檢測，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3、 當(dāng)ΔA大于1.3時，建議將樣本用試劑一稀釋后再進行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

實驗實例：

1、取0.1g大鼠肝臟，進行樣本處理，取上清稀釋24倍后按照操作步驟進行操作，使用96孔板測得計算ΔA=A測定管-A對照管=0.605-0.046=0.559，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.265x+0.0033計算x=2.097，按照樣本質(zhì)量計算酶活得：

HL活性（U/g 質(zhì)量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）÷T×24=50.328 U/g 質(zhì)量。

2、取火雞血清稀釋6倍后按照操作步驟進行操作，使用96孔板測得ΔA=A測定管-A對照管=0.449-0.003=0.446，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.265x+0.0033計算x=1.671，按照樣本質(zhì)量計算酶活得：

HL活性（U/g 質(zhì)量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）÷T×6=1.003 U/g 質(zhì)量。

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