免疫細胞的分離技術(shù) 外周血單個核細胞的分離

用體外方法對機體各種具有免疫反應(yīng)的細胞分別作鑒定、計數(shù)和功能測定，是觀察機體免疫狀態(tài)的一種重要手段。為此，須將各種參與免疫反應(yīng)的細胞從血液或臟器中分離出來。參與免疫反應(yīng)的細胞主要包括淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等。實驗根據(jù)不同需求有的僅需分離白細胞，有的則需分離單個核細胞（mononuclearcell），其中含淋巴細胞和單核細胞（monocyte），有的則需分離T細胞和B細胞以及其亞群。

• 白細胞包括以下細胞

外周血中單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細胞不同，紅細胞和多核白細胞密度較大，為1.090左右，而淋巴細胞和單核細胞密度為1.075～1.090。通過密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。

（一）Ficoll分層液法

主要用于分離外周血中的單個核細胞。其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖（商品名為Ficoll），具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點。高濃度的Ficoll溶液粘性高，易使細胞聚集，唯有與分層液密度相當?shù)膯蝹€核細胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細胞遞經(jīng)洗滌離心重懸。本法分離單個核細胞純度可達95％，淋巴細胞約占90％～95％，細胞獲得率可達80％以上，其高低與室溫有關(guān)，超過25℃時會影響細胞獲得率。

在某些情況下，分離所得細胞需要加以保存，否則活力迅速下降，甚死亡。

（一）短期保存技術(shù)

將分離到的細胞用適量含10％～20％滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。所用培養(yǎng)液要求等滲，具緩沖作用，并對細胞無毒性。通常置4℃保存較好，可減低細胞代謝活動。要注意不要迅速改變細胞所處的溫度，以免造成細胞“溫度”休克。

（二）長期冷凍保存技術(shù)

利用液氮深低溫（－196℃）環(huán)境保存細胞，是當前世界上通用的細胞長期保存技術(shù)。其原理在于深低溫環(huán)境可中斷細胞的代謝，但在降溫過程由于冰晶的形成和滲透壓的改變均可導致細胞的損傷和部分死亡，所以在冷凍過程中一定要加用冷凍保護劑，常用的保護劑為二甲亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）。

（二）Percoll分層液法

這是一種連續(xù)密度梯度離心分離法。Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細胞無毒性。利用Percoll液經(jīng)高速離心后形成一個連續(xù)密度梯度的原理，將密度不等的細胞分離純化。離心后表層為死細胞殘片和血小板，底層為粒細胞和紅細胞，中間有兩層，上層富含單個核細胞(75％)，下層富含淋巴細胞(98％)。該法是純化單核細胞和淋巴細胞的一各較好的方法，但操作流程較長，手續(xù)較多。