FITC熒光標記抗體是目前較為常用的標記抗體的方法，F(xiàn)ITC一般呈黃色、褐色或褐黃色粉末或結晶，性質穩(wěn)定在低溫中能保存數年。在堿性條件下，F(xiàn)ITC的碳酰胺鍵可與抗體蛋白上的賴氨酸氨基共價結合，形成FITC-蛋白質結合物，即熒光抗體或熒光結合物。

　　

　　一個抗體分子上能標記15~20個FITC分子，被標記的抗體仍能保持與相應抗原結合的能力，在熒光燈源紫外線或藍紫光激發(fā)下產生黃綠色熒光，通過熒光顯微鏡進行觀察或利用流式細胞儀分析，從而對抗原進行定性、定位或定量。下面就跟隨小編一起來了解其操作步驟吧！

　　

　　FITC熒光標記抗體的操作步驟：

　　

　　1、用碳酸氫鈉緩沖液pH9.8稀釋抗體為1-5mg/m1，或抗體對該緩沖液充分透析，以足以使賴氨酸不解離(去其正電荷)，但注意保持大部分蛋白質仍未變性；

　　

　　2、將透析袋放入100m1含0.1mg/MIfitc的pH9.8碳酸氫鈉緩沖液(新配制)的燒杯中，用鋁鉑包燒杯以避光，4℃攪拌過夜；

　　

　　3、上述抗體液對PBS在4℃透析以終止反應。其間至少更換PBS液三次，直致480nm的吸收為零；

　　

　　4、加入0.5g/L的疊氮鈉。此后，結合物在4℃避光保存，或分裝后在-20℃凍存。

　　

　　FITC熒光標記抗體注意事項：

　　

　　1、偶聯(lián)反應要求在盡可能接近pH9.8的溶液中進行，而且注意在反應過程中要保持此pH水平；

　　

　　2、要確定在偶聯(lián)反應緩沖液中不含游離氨基(Tris，氨及疊氮鈉均可與FITC反應，因此會降低蛋白質與FITC的偶聯(lián)率)；

　　

　　3、FITC與蛋白質的比值(F/P)，可通過測定495m與280nm吸光度來鑒定。此比值的范圍應為0.3-1.0。